本发明公开了一种从微生物发酵液中分离纯化胞二磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：（1）胞二磷胆碱发酵液，经加热，絮凝，固液分离得到清液，清液经超滤、纳滤连续式预处理得到预处理液；（2）将预处理液上强碱性阴离子交换树脂预柱进行预处理，流出液经强碱性阴离子交换树脂纯化柱吸附，再经氯化钠溶液洗脱，将高纯度洗脱液合并后，经过减压浓缩、醇沉结晶得到胞二磷胆碱钠粗品；（3）将胞二磷胆碱钠粗品活性炭脱色、过滤、浓缩、醇沉结晶、真空干燥得到胞二磷胆碱钠成品，其品质好、收率高、成本低、污染少。