本发明提供了一种大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917的发酵培养方法。在发酵过程初期控制葡萄糖流加量，后期采用蔗糖作为碳源的补充，降低了发酵后期抑制菌体生长乙酸的积累量，同时与优化的培养基和发酵条件相配合提高了活菌体数量，且批次间重复性稳定，有利于生产化工业控制。本发明还提供了以上述发酵培养方法所得大肠杆菌EcN为原料的饲料添加剂的制备方法，将赖氨酸盐酸盐、蛋氨酸、苏氨酸、甜味料和大肠杆菌EcN与水加热混匀后，得到饲料添加剂；通过各原料之间的协同作用，使得制得的饲料添加剂中的营养成分均匀，使用效果好，同时用于制备该添加剂的方法简单、原料易得。