本发明提出了一种生物工程全层人角膜的体外构建方法，细胞培养包括有制取单个细胞、角膜基质细胞培养和角膜内皮细胞制取，首先将捐献者角巩膜环通过100U/ml青霉素和80U/ml链霉素溶液洗剂3遍，然后浸泡在2.4U/mlDispase2溶液中，在孵箱中孵育1小时，然后通过解剖显微镜和显微镊轻轻剥离角膜缘上皮片，再将剥离的上皮片浸泡在0.25％胰酶‑0.02％EDTA溶液中，再次再孵箱中消化5分钟，以此获取单个细胞，本生物工程全层人角膜的体外构建方法，不仅可用于体外药物毒性试验，更重要的是其具备足够的生物力学性能，能够耐受穿透性角膜移植术中缝线的牵拉以及术后眼球内的压力，并且具有良好的生物相容性和生物安全性，因此能够替代供体角膜用于角膜移植。