本发明公开了一种腈水解酶突变体及其构建方法和在普瑞巴林手性中间体合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明分别以芜菁腈水解酶BrNIT和拟南芥腈水解酶AtNIT为亲本，运用肽段替换，将高山南芥腈水解酶AaNIT的225‑285位肽段替换BrNIT氨基酸序列的226‑286位和AtNIT氨基酸序列的225‑285位，获得氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示的腈水解酶突变体BrNIT225‑285及AtNIT225‑285。相比于野生型腈水解酶，本发明提供的腈水解酶突变体催化水解外消旋异丁基丁二腈的活力及产物的立体选择性显著提高，可以满足工业化应用要求，同时在高效催化外消旋异丁基丁二腈合成3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。