本发明公开了一种小分子可溶性肽聚糖的制备方法，包括下述步骤：首先将活化好的细菌菌种配制成菌悬液接入液体培养基中，37℃培养至生长衰败期，再继续培养1~2天；得到的培养基置于沸水中灭活后，离心10分钟后取上清，用三氯乙酸滴至无沉淀，静置8小时，离心取上清；最后将上清液置于8kd透析袋中，蒸馏水透析，然后将透析袋内的剩余液体用95%乙醇沉淀，分离、干燥后得到可溶性肽聚糖。经测定，本发明制备的可溶性肽聚糖的分子量呈弥散性，范围为36KD‑150KD。本发明利用细菌的过渡生长产生自溶现象制备肽聚糖，降低了菌体破碎的要求，工艺流程简单，生产成本也大大降低；得到的肽聚糖溶解度和免疫活性高，为肽聚糖应用于医学检验等方面提供了可能性。