本发明属于生物工程领域，涉及腺苷三磷酸的制备。本发明提供了一种重组表达载体以及包含所述载体的重组表达宿主，所述重组表达载体包含编码腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸；本发明还提供了使用所述重组表达宿主合成腺苷三磷酸的方法。本发明通过使用所述重组表达宿主全细胞催化合成腺苷三磷酸，提高了腺苷转化率、ATP产率和反应效率，同时反应体系组分简单、成本低。