本发明提供了一种丙谷二肽的制备方法，包括在α‑氨基酸酯酰基转移酶存在下，以L‑丙氨酸甲酯盐酸盐和L‑谷氨酰胺为底物配制反应液，调节所述反应液的pH为7.0‑9.0，在恒定温度20‑40℃下反应后，收集得到丙谷二肽；所述α‑氨基酸酯酰基转移酶来源于脑膜败血伊丽莎白菌；所述α‑氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列包括如SEQIDNO：1‑SEQIDNO：6中任意一项所示的氨基酸序列。该制备方法高效简便，成本低，转化率高，绿色环保，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了丙谷二肽制备用酶及应用。