本发明属于清洁能源技术领域，涉及一种以蚕蛹油制备生物柴油的方法。本发明包括以下步骤：a、将蚕蛹油、正己烷、甲醇、催化剂Novozyme435固定化脂肪酶加入三口瓶中，在35℃温度下搅拌反应；b、测定酸值≤0.5后，过滤回收催化剂，静置分层除去少量的水；c、加入甲醇、催化剂LipozymeTLIM固定化脂肪酶，在40℃温度下搅拌反应；d、过滤回收催化剂，在‑0.09MP下减压蒸馏回收正己烷及甲醇，在‑0.01MP下减压蒸馏，得生物柴油。本发明的工艺简单，所采用的催化剂回收套用，对环境友好，经济且环保，所得生物柴油的产品纯度高、转化率高，生产成本低，是未来生物柴油生产的重要补充形式。