本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种NSE检测试纸条的制备方法以及按照该方法制备得到的试纸条、检测卡和NSE检测试剂盒。该NSE检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接设置在所述底板上，其中，所述结合垫上固定有NSE抗体‑荧光微球复合物，所述硝酸纤维素膜上设有检测线T线和质控线C线，所述C线设置在靠近所述吸水垫的一端；所述T线处包被有抗NSE单克隆抗体，所述C线处包被有羊抗鼠IGg多克隆抗体。该NSE检测试纸条用于检测NSE检测速度快，无需依赖大型医疗设备。