本发明提供了重组猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该重组PCV2Rep蛋白的制备包括构建PCV2Rep蛋白基因克隆载体及基因的改造；构建重组PCV2Rep蛋白表达质粒载体、工程菌；重组PCV2Rep蛋白的诱导表达及纯化；再用重组PCV2Rep蛋白制备猪圆环病毒2型Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒，能检测出猪血清中PCV2野毒感染抗体和PCV2全病毒灭活疫苗或全病毒弱毒疫苗免疫抗体，而对PCV2Cap蛋白基因工程亚单位疫苗免疫猪血清抗体检测呈阴性反应；结合PCV2Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒的应用，可区分亚单位疫苗免疫猪与野毒感染猪，便于养猪场的PCV2病毒净化。