本发明公开了一种蔗糖磷酸化酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明以重组枯草芽孢杆菌SPase/pBSMuL3作为生产菌株，LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为7.75U/g，酶活回收率达到110.85％；LX‑1000EA固定化蔗糖磷酸化酶的酶活为9.54U/g，酶活回收率达到101.82％。在相同的转化时间内，以0.5M蔗糖和0.5M葡萄糖为底物连续操作11次，氨基化树脂LX‑1000EA固定化SPase保持39.15％的转化率，94％的残留酶活；氨基化树脂LX‑1000HA固定化SPase保持42.5％的转化率，91％的残留酶活。结果表明，该固定化方法操作简单，固定化酶酶活没有损失，且应用效果很好，具有很高的工业化应用潜力。