本发明公开了一种从人血浆中同时分离纯化凝血因子IX、X和Ⅶ的方法，通过离心除杂、凝胶吸附及超滤浓缩以制备的凝血酶原复合物，经阴离子交换树脂柱分离出凝血因子Ⅶ和含Ⅸ、Ⅱ的混合液，再将含Ⅸ、Ⅱ的混合液经亲和层析分离出凝血因子Ⅱ和Ⅸ。本发明通过将阴离子交换层析与肝素亲和层析相结合，实现了同时对3种凝血因子Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ进行分离、制备，不仅原料利用高，且操作简单、耗时短；同时通过在层析过程中通过对电信号的检测，准确收集相应的凝血因子，有效提高凝血因子纯度，提高经济效益。