一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种蛹虫草纤维蛋白溶解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其基因序列如SEQIDNO.2所示，其可应用于溶栓。本发明通过一系列的酶学性质及体外体内溶栓性质初步研究证明了该酶具有较好的溶栓活性，并借助构建其他动物血栓模型，揭示其体内溶栓机理，借助毒理学试验，发掘其临床应用的安全性，为今后新的治疗血栓药物或者功能性食品的开发提供科学证明及数据支撑。