本发明涉及荧光免疫层析技术领域，具体涉及一种CKAP4标记抗体‑荧光微球复合物的制备方法及其应用。一种CKAP4标记抗体‑荧光微球复合物的制备方法，包括如下步骤：(1)用EDC振荡活化荧光微球；(2)使荧光微球与CKAP4标记抗体偶联；(3)加入5％‑15％BSA溶液振荡封闭，离心，去上清；(4)加入保护液，超声，振荡偶联，离心，去上清；(5)加入5％‑15％BSA溶液，振荡封闭，振荡结束后离心，去上清，沉淀用保护液吹散，即得所述CKAP4标记抗体‑荧光微球复合物溶液。该CKAP4标记抗体‑荧光微球复合物用于制备免疫荧光层析试纸条可实现CKAP4的快速检测，线性范围宽。