本发明涉及一种产胆固醇氧化酶的蜡样芽孢杆菌的发酵产酶方法，属于生物工程领域。该方法是以蜡样芽孢杆菌菌株为菌种进行发酵产酶，进而制备出胆固醇氧化酶。本发明通过筛选优化所得的发酵培养基和产酶方法具有发酵周期端，条件温和，易于控制，提供的最佳发酵条件，具有产酶效率高，且酶活力高，酶活力稳定等优点，有利于后一步进行应用方面研究。