本发明公开一种大规模引物冷凝电泳纯化分离的方法，涉及生物工程纯化技术领域。该方法包括16％预制胶配制、10xTBE缓冲液配制、PAGE胶配制、加样跑样四个步骤，上样前加饱和尿素溶解引物，一方面可以使样品变性，另一方面可以增加样品比重，使得样品加入凹槽时使引物下沉，与分离方法配套的凝胶电泳槽包括低温恒温箱、电泳槽主体，电泳槽主体放置于低温恒温箱的内部，低温恒温箱内设有冷凝器、第二温度传感器并盛装有乙醇，通过冷却乙醇的循环冷却，能够保持电泳缓冲液的低温恒温，不会造成由于温度升高而使条带变形的情况，大大节约了需要更换缓冲液的控温成本。