本发明公开了一种用于λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法。属于生物技术工程领域。本发明提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。