本发明公开了一种贵金属和MoO3自组装材料的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：第一步：纳米MoO3的合成；第二步：纳米贵金属颗粒的合成；第三步：将第一步合成的纳米MoO3溶解在去离子水中，加入硅烷偶联剂，搅拌后加入第二步合成的纳米贵金属颗粒，超声震荡，用分散剂离心处理，得到所述贵金属和MoO3自组装材料。将所述贵金属和MoO3自组装材料溶解后滴到基板上，真空干燥后得到SERS衬底。本发明利用非原位的方法避免了水热合成法对样品造成的损害，避免了热蒸发法中，严格的实验条件，如添加催化剂、高温反应或真空条件，还避免了原位生长法控制负载的惰性核动力源的形态变得困难，从而对SERS的活性产生很大的影响的弊端。