本发明适用于微生物技术领域，提供了一种大肠杆菌活化发酵方法，包括：取出大肠杆菌接种于培养基上，得到一级平板；取单菌落继续接种于培养基上，得到二级平板；取多个单菌落接种于液体培养基中，旋转培养得到一级种子液；取一级种子液继续接种于液体培养基中，旋转培养得到二级种子液；取二级种子液接种于发酵底液中进行发酵，并采取溶氧反馈的方式进行补料；加入诱导培养基诱导蛋白表达，并采取恒pH补料进行补料继续进行发酵。本发明实施例提供的大肠杆菌活化发酵方法，通过两次平板培养以及两次液体培养，得到二级种子液，能够有效地实现菌种的复壮，有效提高了后续发酵过程的稳定性以及目标产物的表达量。